western blotting western blotting( 二 ) _生活百科

24、若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可通过使用1ml注射器反复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
25、 ⑹待样品恢复到室温后上样。
26、 2．培养的细胞（定量）： ⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
27、 ⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min 。
28、 ⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
29、 ⑷12000g离心，4℃，2min 。
30、 ⑸取少量上清进行定量。
【western blotting western blotting】31、 ⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min 。
32、 3．组织： ⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。
33、可手动或电动匀浆。
34、注意尽量保持低温，快速匀浆。
35、 ⑵12000g离心，4℃，2min 。
36、 ⑶取少量上清进行定量。
37、 ⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loadingbuffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loadingbuffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min 。
38、 (裂解液配方：Tris-Cl(pH7.4)20mM，EDTA1mM 由于蛋白酶抑制剂可影响蛋白定量，且新鲜蛋白很少降解，故可不加，如加按建议比例即可。
39、提取磷酸化的蛋白还需加Na3VO40.1mM及NaF25mM）。
40、 1×loadingbuffer配方：10%甘油，50mMTris?Cl(pH6.8)，2%β-巯基乙醇，0.2~0.5‰溴酚蓝，2%或5%的SDS 。
41、Buffer可配成2×~5×，注意SDS终浓度勿超过10% 。
42、对于心脏，肌肉等碎屑较多的组织可用5%的SDS，肝肾等组织2%即可。
43、) (三)电泳 1．上样前将胶板下的气泡赶走。
44、 2．所有蛋白样品调至等浓度后上样，样品两侧的泳道用等体积的1×loadingbuffer上样，Marker也用1×loadingbuffer调整至与样品等体积。
45、 2．以初始电压为45V时的电流强度进行稳流电泳，当电压达65V时改为稳压电泳。
46、 3．在目的蛋白泳动至距胶下缘1cm以上结束。
47、电泳液配方：Tris-base3g,glycine14.4g,0.1%SDS（10ml10%SDS）/L Tris-base1.5g,glycine7.2g,0.1%SDS（5ml10%SDS）/0.5L (四)转膜 1．电泳结束前20分钟左右戴上手套开始准备：湿转使用常规电转液：Tris3.0g，Gly14.4g，M-OH200ml，加去离子水至1,000ml 。
48、干转则取此转移液，每50ml加入10%SDS180ul 。
49、浸泡NC膜：将NC膜平铺于去离子水面，靠毛细作用自然吸水后再完全浸入水中10min以排除气泡，随后浸泡入转移液中。
50、PVDF膜则在M-OH中浸泡20min以上后转入转移液中。
51、将滤纸也浸入转移液中。
52、 2．取胶：将胶卸下，保留30-100KD或分子量范围更广些的胶（以便以后杂其他感兴趣的蛋白），左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，置于洁净玻璃板上，按顺序铺上膜与每侧一张（干转每侧三张）滤纸。
53、注意用玻棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分（尤其是干转，以防止短路） 3．转膜：湿转：电转槽用去离子水淋洗晾干，加入1,000ml电转液。
54、将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。
55、降温，将电泳槽置于冰水混合物中。
56、恒流100mA过夜，或400mA，4h 。
57、注意不同蛋白的要求不同。
58、干转：用电转液淋洗石墨电极，滤纸吸干，铺上胶，再滴少许电转液，以1.5mA/cm2凝胶面积转移1-2小时。
59、负载电压不宜超过1V/cm2胶面积。